ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для количественного

определения ДНК вируса гепатита Б (HBV)

методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ГЕПАТОГЕН-Б КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ

Регистрационное удостоверение МЗ СР РФ

ФСР 2008/03506

ВНИМАНИЕ! Изучите инструкцию перед началом работы

УТВЕРЖДЕНО

Федеральной службой по надзору в

сфере здравоохранения и социального

развития «01» сентября 2006 г .

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для количественного определения ДНК вируса гепатита Б (HBV) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ГЕПАТОГЕН-Б КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ

1. НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. Набор реагентов ГЕПАТОГЕН-Б КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ предназначен для количественного определения ДНК вируса гепатита Б (Hepatitis B virus) в образцах плазмы крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени .

1.2. Набор реагентов ГЕПАТОГЕН-Б КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ может быть использован в клинической практике для диагностики гепатита Б и оценки эффективности противовирусной терапии .

2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1. Принцип действия Принцип метода основан на использовании процесса амплификации ДНК, заключающемся в повторяющихся циклах:

температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taqполимеразой .

В реакционную смесь для проведения ПЦР введены ДНКзонды, каждый из которых содержит флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) увеличивается пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации .

Использование калибровочных образцов (СТ) позволяет построить калибровочную прямую, при помощи которой можно определить концентрацию ДНК HBV в исследуемых образцах плазмы крови .

Исследование с использованием набора реагентов

ГЕПАТОГЕН-Б КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ состоит из следующих этапов:

выделение ДНК (пробоподготовка) и ПЦР-амплификация ДНК HBV в режиме реального времени .

На стадии выделения ДНК в реакционную смесь добавляют внутренний контрольный образец (ДНК-ВК), предназначенный для оценки эффективности всех этапов исследования. ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой ДНК и внутреннего контрольного образца, помечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно, что позволяет раздельно регистрировать результаты амплификации внутреннего контрольного образца и искомой ДНК .

Для проведения количественной оценки ДНК HBV, набор реагентов ГЕПАТОГЕН-Б КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ включает калибровочные образцы в двух концентрация: 1,0 106 копий/мл и 3,0 103 копий/мл .

Для проведения ПЦР используют детектирующий амплификатор .

Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоёв, разделённых прослойкой из парафина .

Смешение слоёв и превращение их в амплификационную смесь происходит только при плавлении парафина, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки .

2.2. Состав набора

Набор состоит из трёх комплектов:

– &nbsp– &nbsp–

3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ

Аналитическая специфичность: набор реагентов выявляет все субтипы вируса гепатита Б .

В образцах, содержащих ДНК HBV, определяется концентрация вируса в исследуемом материале. В образцах, не содержащих ДНК HBV, результат исследования должен быть отрицательным .

Чувствительность анализа: не более 300 геномэквивалентов (копий) ДНК HBV на 1,0 мл плазмы .

Линейный диапазон концентраций ДНК HBV, определяемых детектирующим амплификатором, составляет 7,5 102 – 1,0 108 копий/мл образца, отклонение от линейности не превышает 7% .

Коэффициент вариаций результатов определений – не более 7% .

4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

4.1. Потенциальный риск применения набора – класс 3 (ГОСТ Р 51609–2000) .

4.2. Мерами предосторожности при работе с комплектом реагентов является соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарноэпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.) .

4.3. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными .

4.4. Работу с набором реагентов и анализируемыми образцами следует проводить в одноразовых медицинских перчатках без талька .

4.5. На стадиях приготовления реакционной смеси и обработке образцов крови необходимо использовать только новые наконечники и пробирки .

4.6. Не допускается использование одних и тех же наконечников при обработке различных образцов крови .

4.7. Выделение ДНК следует проводить в ламинарных шкафах с включённым ламинарным потоком. Приготовление реакционной смеси следует проводить в ПЦР-боксах .

4.8. Для предотвращения контаминации этапы выделения ДНК и ПЦР следует проводить в раздельных помещениях или тщательно изолированных зонах, снабжённых комплектами полуавтоматических пипеток, халатами, стеклянной посудой и прочими принадлежностями .

4.9. Всё лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, халаты, головные уборы и пр., а также растворы реагентов должны быть строго стационарными. Запрещается их перемещение из одного помещения в другое .

4.10. Поверхности рабочих столов, а также помещений, в которых проводится ПЦР, следует обрабатывать бактерицидными облучателями до и после окончания работ в течение 1 часа .

4.11. Использованные одноразовые принадлежности (пробирки, наконечники) должны сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор .

– &nbsp– &nbsp–

6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

6.1. Взятие образцов периферической крови Взятие крови проводится в пластиковые пробирки объёмом 2,5 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл. Для перемешивания содержимого пробирку переворачивают 2–3 раза .

В качестве антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия .

ВНИМАНИЕ! Не допускается использование гепарина в качестве антикоагулянта .

6.2. Транспортировка и хранение исследуемого материала ВНИМАНИЕ! Время от взятия материала до получения плазмы не должно превышать 6 часов .

Транспортировать и хранить образцы крови до начала исследования при 2–8°С .

6.3. Получение плазмы 6.3.1. Пробирки с кровью центрифугировать при 3000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре (18–25°С) .

6.3.2. После центрифугирования отобрать автоматической пипеткой верхнюю фракцию (плазма) и перенести в отдельную пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл .

Хранить полученную плазму при температуре минус 20°С не более 3 месяцев .

7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1. Выделение ДНК из плазмы крови Примечание. Перед началом работы необходимо достать из холодильника комплект реагентов для выделения нуклеиновых кислот и проконтролировать отсутствие осадка в лизирующем растворе. В случае выпадения осадка лизирующий раствор прогреть при 65°С до полного растворения осадка .

На данном этапе используйте только наконечники с маркировкой «RNAase-free, DNAase-free» .

Для повышения достоверности получаемых результатов на этапе выделения ДНК исследуемые образцы необходимо продублировать (для одного исследуемого образца провести две отдельные пробоподготовки) .

7.1.1. Для исследования необходимо промаркировать следующее количество пластиковых пробирок объёмом 1,5 мл:

по 2 пробирки на каждый исследуемый образец плазмы;

1 пробирку для отрицательного контрольного образца («K–»);

1 пробирку для положительного контрольного образца («K+») .

Например: для исследования 10 образцов необходимо промаркировать 22 пробирки (20 пробирок для исследуемых образцов, 1 пробирка «K+», 1 пробирка «K-») .

7.1.2. Внести во все промаркированные пробирки по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ДНК-ВК) .

7.1.3. Добавить в каждую пробирку по 300 мкл лизирующего раствора, не касаясь краёв пробирки .

7.1.4. В пробирки для исследуемых образцов добавить по 100 мкл плазмы крови. В пробирку, промаркированную «K–», добавить 100 мкл отрицательного контрольного образца; в пробирку, промаркированную «K+», добавить 100 мкл положительного контрольного образца ДНК .

7.1.5. Плотно закрыть крышки пробирок, встряхнуть на вортексе в течение 3–5 с .

7.1.6. Термостатировать пробирки в течение 15 мин при температуре 65°С, осадить конденсат центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 с при комнатной температуре (18–25°С) .

7.1.7. Добавить в каждую пробирку по 400 мкл реагента для преципитации, встряхнуть на вортексе в течение 3–5 с .

7.1.8. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре (18–25°С) .

7.1.9. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником .

7.1.10. Добавить к осадку по 500 мкл промывочного раствора №1, закрыть крышки пробирок и перемешать, 3–5 раз аккуратно перевернув пробирки .

7.1.11. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре .

7.1.12. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником .

7.1.13. Добавить к осадку по 300 мкл промывочного раствора №2, закрыть крышки пробирок и перемешать, 3–5 раз аккуратно перевернув пробирки .

7.1.14. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре .

7.1.15. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником .

7.1.16. Открыть крышки пробирок и высушить осадок при температуре 65 °С в течение 5 мин .

7.1.17. Добавить к осадку 25 мкл буфера для растворения и прогреть пробирки при температуре 65°С в течение 10 мин .

Встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3–5 с .

7.1.18. Осадить конденсат центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 с при комнатной температуре .

Препарат ДНК готов для постановки полимеразной цепной реакции .

Препарат ДНК можно хранить при температуре минус 20°С не более 1 месяца или при температуре минус 70°С не более одного года .

7.2. Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции 7.2.1. Разморозить при комнатной температуре (18–25°С) ПЦРбуфер из комплекта реагентов для ПЦР-амплификации, затем тщательно перемешать на вортексе ПЦР-буфер и Taqполимеразу. Осадить капли центрифугированием при 1000– 3000 об/мин в течение 3–5 с при комнатной температуре (18–25°С) .

7.2.2. Промаркировать необходимое количество пробирок со смесью для амплификации, запечатанной парафином, для исследуемых образцов плазмы крови, положительного контрольного образца ДНК «K+», отрицательного контрольного образца «K–» и по три пробирки для каждого из калибровочных образцов («СТ1» и «СТ2») .

7.2.3. В отдельной пластиковой пробирке приготовить смесь ПЦРбуфера с Taq-полимеразой:

10 х (N+1) мкл ПЦР-буфера, 0,5 х (N+1) мкл Taq-полимеразы, где N – количество промаркированных пробирок .

ВНИМАНИЕ! Taq-полимеразу желательно держать вне морозильной камеры как можно меньше времени .

7.2.4. Смесь перемешать на вортексе и осадить капли центрифугированием при 1000–3000 об/мин в течение 3– 5 с при комнатной температуре (18–25°С) .

Смесь можно хранить при комнатной температуре не более 1 часа .

7.2.5. Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавить по 10 мкл тщательно перемешанной смеси ПЦР-буфера с Taq-полимеразой .

7.2.6. В каждую пробирку добавить по 1 капле минерального масла (20 мкл), закрыть пробирки .

Примечание. Во избежание контаминации рекомендуется вносить образцы ДНК наконечниками с фильтрами .

7.2.7. Пробирки с препаратом ДНК встряхнуть на микроцентрифуге/вортексе и осадить капли центрифугированием при 1000–3000 об/мин в течение 3– 5 с .

7.2.8. Внести в пробирки (кроме пробирок «K–», «K+», «СТ1» и «СТ2»), по 5,0 мкл препарата ДНК, не повреждая слой парафина .

7.2.9. В пробирку, промаркированную «K–», не повреждая слой парафина, внести 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего пробоподготовку .

7.2.10. В пробирку, промаркированную «K+», внести 5,0 мкл положительного контрольного образца, прошедшего пробоподготовку .

7.2.11. В пробирки, маркированные «СТ1» и «СТ2», не повреждая слой парафина, внести по 5,0 мкл соответствующего калибровочного образца .

7.2.12. Осадить капли центрифугированием при 1000–3000 об/мин в течение 3–5 с при комнатной температуре (18–25°С) .

7.2.13. Установить все пробирки в блок детектирующего амплификатора и провести ПЦР в режиме, приведённом в таблицах 1 и 2, с учётом объёма реакционной смеси, равного 35 мкл .

– &nbsp– &nbsp–

8. РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

8.1. Регистрация результатов амплификации с использованием детектирующих амплификаторов ДТ-322, ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология»), iСycler iQ (Bio-Rad Laboratories) Для проведения количественного определения ДНК HBV необходимо оформить протокол исследования, в котором должны быть указаны маркировка анализируемых образцов и концентрация калибровочных образцов .

После окончания амплификации прибор автоматически построит калибровочную прямую, определит концентрацию вируса в анализируемых образцах и сформирует протокол по результатам анализа .

Для более подробного описания процедуры проведения анализа см. «Руководство по эксплуатации» для ДТ-322, ДТ-96, «Руководство пользователя» для iCycler iQ .

9. УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ ВНИМАНИЕ! Для приборов ДТ-322 и ДТ-96 указаны значения вирусной нагрузки для Метода анализа «Геометрический (Cp)» .

9.1. Эффективность амплификации должна составлять 90– 100% .

9.2. Учёт и интерпретация результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с приборами ДТ-322, ДТ-96 и iCycler iQ .

9.3. Если значение вирусной нагрузки находится в пределах 7,5 102 – 1,0 108 копий/мл, результат определяется как положительный с указанием вирусной нагрузки в образце (копий/мл) .

9.4. Если значение вирусной нагрузки выходит за рамки линейного диапазона, то для образцов с низкой вирусной нагрузкой (значение, определённое программой, меньше 7,5 102 копий/мл) результат фиксируется как: «менее 7,5 102 копий/мл». Для образцов с высокой вирусной нагрузкой (значение, определённое программой, больше 1,0 108 копий/мл) результат фиксируется как: «более 1,0 108 копий/мл» .

9.5. В отрицательном контрольном образце программа фиксирует отрицательный результат на наличие ДНК HBV и положительный результат амплификации внутреннего контрольного образца .

9.6. В положительном контрольном образце определяемая концентрация ДНК должна находиться в диапазоне 2,2 104 – 7,1 104 копий/мл .

9.7. В случае отрицательного результата на наличие ДНК HBV (канал FAM) и отрицательного результата амплификации внутреннего контрольного образца (канал HEX), результат трактуется как недостоверный. В этом случае необходимо повторить исследование .

9.8. При получении положительного результата на наличие ДНК HBV в отрицательном контрольном образце, результаты всей постановочной серии считают недостоверными. В этом случае необходимо проверить специальных мероприятий для устранения контаминации и повторное проведение исследования всей постановочной серии .

10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА

10.1. Срок годности набора – 6 месяцев с даты изготовления .

10.2. Комплект калибровочных образцов и комплект реагентов для ПЦР-амплификации, кроме пробирок со смесью для амплификации, запечатанной парафином, следует хранить при температуре минус 20°С в течение всего срока годности. Допускается хранение калибровочных образцов, ПЦР-буфера, минерального масла и положительного контрольного образца ДНК при температуре 2–8°С в течение всего срока годности набора .

10.3. Пробирки со смесью для амплификации, запечатанной парафином, и комплект реагентов для выделения нуклеиновых кислот следует хранить в тёмном месте при 2– 8°С в течение всего срока годности набора .

По вопросам, касающимся качества набора ГЕПАТОГЕН-Б

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ, следует обращаться в ООО «НПО ДНКТехнология» по адресу:

117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, корп.6, этаж 11 Тел./факс + 7 (495) 980-45-55 Е-mail: help@dna-technology.ru www.dna-technology.ru и в Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ «НЦЭСМП» Росздравнадзора:

117246, Москва, Научный проезд, д. 14а Тел.: +7 (495) 120-60-95, 120-60-96 Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»:

http://www.dna-technology.ru/support/